Finding the Achilles’ heel of Brassica for Black Rot disease

Finding the Achilles’ heel of Brassica for Black Rot disease

Organisatie-onderdeel

TKI TU

Projectcode

TU18024

MMIP

Landbouw, Water, Voedsel>Sleuteltechnologieën LWV>Biotechnologie en Veredeling

Startdatum

01/01/19

Einddatum

31/12/22

Samenvatting

Black Rot caused by the bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is the most important
disease for Brassica crops worldwide, including the Netherlands, with little natural resistance sources
available for breeding in B. oleracea. This pathogen thrives in warm-humid conditions and spreads readily
with rain splash, wind-blown water droplets, and mechanical wounding. Consequently, Xcc problems
progress throughout the growth season. Moreover, Xcc is a seed-born pathogen, meaning that new
infections on virgin soils are always under the suspicion of a seedborne contamination, and eradication of
the bacterium is nearly impossible in infected fields. As with most bacterial pathogens, management is very
difficult with no chemical treatments available that block systemic infections. Currently, copper-based
bactericides are applied as foliar spray to reduce bacterial spread in the field, however, with little
effectiveness.
Problem statement: Genetic resources for Xcc resistance are scarce in the Brassica germplasm. Here we will
screen for key host proteins that are actively manipulated by Xcc to promote bacterial virulence. The
corresponding plant genes will be direct targets for mutagenesis screens in Brassica to obtain durable resistance by applying these genes as altered or loss of Susceptibility genes. A well-known example of such a
‘susceptibility gene approach’ is loss-of-function mutation in the Mlo genes, which in many crops yields
durable resistance against Powdery and Downy mildews. Our consortium has the know-how to perform
screens in the model plant Arabidopsis to identify novel sources of resistance against Xcc and to then
translate this knowledge into breeding programs for Brassica rapa and B. oleracea crops.
We here propose to perform a protein-protein interaction study that aims to identify host proteins
manipulated by the pathogen and to test if the corresponding genes are important for disease development.
A key innovation is that we will focus on bacterial proteins that do not suppress host immunity, yet bear all
characteristics that they manipulate host processes. In this way, we expect to find novel plant genes that are
important for Xcc disease development, as this bacterium has a unique entry strategy, namely via the reuptake
of guttation droplets into the hydathodes.
Any confirmed and subsequently altered/loss of Susceptibility gene will provide significant added value for
the Dutch breeding industry, while reducing the yield losses experienced for growers. Second, application of
these genes will likely reduce the use of copper-based bactericides, which will have a positive impact on our
environment and ecosystem (including bees, birds, fish and invertebrates). Consequently, consumers will
obtain a high-end GMO-free end product with less residuals and a reduced environmental footprint. With
Brassica crops being grown worldwide, the outcomes of this research will have a global impact. The findings
can potentially be translated to other crops and other bacterial diseases (under license).

Doel van het project

A2 Gezonde, robuuste bodem en teeltsystemen gebaseerd op agro-ecologie en zonder schadelijke emissies
naar grond- en oppervlaktewater: Op dit moment is er geen resistentie-gen beschikbaar dat deze bacteriële
ziekte in koolsoorten kan voorkomen. Dit project zoekt naar een natuurlijke bron voor recessieve resistentie
tegen deze ziekte, waardoor er minder met koper-bevattende spuitmiddelen gespoten hoeft te worden. Dit
doen we door het bacteriële infectieproces in detail te bestuderen en daarbij de zwaktes van de plant in
kaart te brengen. In eerste instantie is onze invalshoek om bacteriële eiwitten te bestuderen die direct
bijdragen aan de virulentie strategie van het pathogeen.
D2 Gezonde voeding een makkelijke keuze: Het onderzoeksprogramma is erop gericht om een duurzame
oplossing voor dit landbouwprobleem te vinden die gebaseerd is op genetische variatie in planten. De
oplossing zal liggen in het identificeren van essentiële stappen in het infectieproces (zowel aan de bacterieals
plant-kant), te kijken of daar genetische variatie voor is in planten, waarmee de vatbaarheid voor deze
ziekte verminderd kan worden. Deze genetische variatie zal middels gene editing of ‘GMO-vrije’ methodes in
gewassen ingebracht gaan worden. Ons onderzoeksdoel is om planteneiwitten te vinden die door de
bacterie gemanipuleerd worden en te bestuderen welke processen in de plant daarmee voor de bacterie van
belang zijn. Tevens zoeken wij naar een natuurlijke vorm van passieve of actieve plantenafweer die de
infectie vertraagt dan wel reduceert via de waterporiën.

Relatie met missie (Motivatie)

A2 Gezonde, robuuste bodem en teeltsystemen gebaseerd op agro-ecologie en zonder schadelijke emissies
naar grond- en oppervlaktewater: Plantenziekten veroorzaakt door het genus Xanthomonas vormen een
groot landbouwprobleem (op tomaat, paprika/rode peper, banaan, citrusvruchten, cassave, rijst, sla, en
koolsoorten). Dit project helpt om de virulentie strategie te begrijpen van bacteriën die via hydathoden
(waterporiën) binnendringen. Door de functie van bacteriële virulentie-eiwitten te bestuderen in de
modelplant Arabidopsis, wordt nieuwe kennis genereerd die vervolgens weer toepasbaar is in gewassen.

Geplande acties

WP 1 (& 3): Om plant specifieke processen te vinden die bijdragen aan het ziekteproces, zoeken we naar
planteneiwitten/structuren, die door Xanthomonas gemanipuleerd worden. We maken daarbij bv. gebruik
van ‘proximity labeling’ in plantencellen (i.p.v. een eiwit-eiwit interactie studie in gist). Aangezien er bij
aanvang v/h project een vergelijkbare studie in gist was gepubliceerd is er voor een alternatieve nieuwe
methode gekozen1. Daarnaast kunnen met deze geadvanceerde techniek eiwit-interacties tijdens een
bacteriële infectie in planta bestudeerd worden. Deze methode wordt nu geoptimaliseerd door ons. Eerst
richten wij ons op de natuurlijke injectie van de bacteriële virulentie eiwitten (Type 3 effectoren, T3E) door
deze eiwitten door pathogene bacteriën zelf d.m.v. het bacteriële injectosome (TTSS) te laten inbrengen in
plantencellen. De benodigde DNA-vectoren zijn inmiddels verkregen en worden nu aangepast voor ons
doeleinde. Als mogelijke alternatieve strategie maken we gebruik van transiënte expressie van deze
bacteriële genen in planta middels Agrobacterium tumefaciens. ‘Proof-of-concept’ voor de methode zal
verkregen worden met T3E XopAC, een eiwit dat interacteert met Cytoplasmic receptor-like kinase (CRLK)
eiwitten in plantencellen. Een succesvolle injectie van deze vreemde bacteriële eiwitten in de plantencel
willen we zichtbaar maken door een afweerreactie van het immuunsysteem op te wekken in resistente
planten (zie ook WP3).
- De 28 bekende T3Es van ons model isolaat van Xcc (strain 8004) zijn inmiddels allen gekloneerd (WP2 3.a);
deze bacteriële genen kunnen nu in verschillende vectoren voor eiwit-expressie gekloneerd worden (via
Gateway klonering) voor in planta eiwitexpressie studies waarna we de voornoemde affiniteitszuivering
(proximity labeling of co-immunoprecipitatie) kunnen uitvoeren. We maken gebruik maken van een
‘Effector-to-Host delivery’ systeem (pEDV6) voor de proximity labeling. Hierbij worden de Xcc T3E eiwitten
geïnjecteerd in de plantencel door (i) Pseudomonas syringae pv. tomato of (ii) X. campestris (strain
CFBP7700). Vervolgens kunnen wij gericht interacterende planteneiwitten modificeren door een
enzymsubstraat (biotine) op de planten aan te brengen. Dankzij deze eiwitmodificatie kunnen wij alle
gemodificeerde planteneiwitten en bloc opzuiveren en identificeren (m.b.v. proteomics). Als alternatief
hebben wij de beschikking over een X. campestris isolaat (CFBP7700) dat zelf (bijna) geen T3E genen bevat,
maar wel de genetische code draagt voor het bacteriële injectosome van Xcc op een heteroloog plasmide.
M.b.v. van dit systeem kunnen we gericht steeds één effector inbrengen in plantencellen.
WP 2: Daarnaast is het volledige genoom van 96 X. campestris isolaten (WP2 1.a) via Nanopore sequencing
verkregen. De helft van deze isolaten infecteert de plant via hydathoden (pv. campestris), de andere helft via
huidmondjes (pv. raphani). Deze isolaten zijn geselecteerd uit een nieuw opgebouwde in-house collectie van
±200 isolaten, die allen in een ziektetoets op koolplanten getest zijn zodat de virulentie-strategie van elk
isolaat bekend is. Het pan-genoom van deze isolaten wordt momenteel onderling vergeleken om significante
genetische verschillen te identificeren, die correleren met de virulentie strategie. Inmiddels is er een
beperkte set aan bacteriële genen geïdentificeerd die (bijna) 100% correleert met de strategie (WP2 2a-2c).
De rol van deze genen voor het infectieproces zal in 2022 bepaald worden door deze genen te muteren in
Xcc (eerst alleen, daarna in combinatie). Tevens hebben we nu een goed beeld van de T3E die ‘breed
geconserveerd zijn in Xcc’ en welke juist variabel zijn. Op basis van (tenminste) twee publicaties2 zullen we een voorselectie maken van de T3E die niet het afweersysteem (lijken) te onderdrukken en maar wel breed
geconserveerde zijn. Daarbij zullen we vooral kijken naar T3E met (i) een onbekende virulentie functie of (ii)
onbekende doeleiwit in plantencellen.
- Middels virulentieproeven in Arabidopsis en Nicotiana benthamiana met Pseudomonas en Xanthomonas
hebben wij aangetoond dat ‘water-soaking’ een virulentie strategie is die zeer waarschijnlijk noodzakelijk is
voor de infectie van hydathoden (WP2 3.b). Op dit moment zoeken we gericht naar een Xcc T3E die ‘water
soaking’ stimuleert. Hierbij proberen we ‘water soaking’ te complementeren in trans door Xcc T3Es in een P.
syringae pv. tomato mutant tot expressie te brengen. Deze mutant kan niet langer ‘water soaking’
induceren door het verlies van twee T3Es. Deze T3E zal een belangrijk virulentie-eiwit zijn tijdens onze
vervolgstudies. Als we ‘water-soaking’ kunnen ontregelen, dan zijn planten mogelijk sterk vermindert
vatbaar voor deze ziekte. Het omgekeerde is eerder aangetoond voor Pseudomonas-Arabidopsis, waarbij
verlies van het T3E doeleiwit in planten juist een situatie deed ontstaan waarbij de planten overmatig
gekolonialiseerd worden door allerlei epifytische bacteriën.
Milestone 3: We trachten op dit moment een Xcc mutant te maken die niet (langer) herkend wordt door het
immuunsysteem van Arabidopsis. We maken daarbij gebruik van een wereldwijde plantencollectie van >700
natuurlijke accessies. Er zijn inmiddels (voldoende) verse zaden verzameld van al deze accessies. Vervolgens
zullen we ‘screen’ uitvoeren om te bepalen welke van de 28 T3E herkend wordt door planten in deze
Arabidopsis collectie. Hierbij maken we opnieuw gebruik van het Pseudomonas ‘Effector-to-Host delivery’
systeem (pEDV6), omdat het P. syringae pv. tomato DC3000 nauwelijks herkend wordt door planten uit deze
collectie. Dit zal ons twee onderzoeksresultaten opleveren: (1) We zullen nieuwe resistentiegenen vinden in
de Arabidopsis populatie samen met het bijbehorende Avirulentiegen (Avr) en (2) we kunnen de meest
belangrijke Avr genen muteren, waardoor er mogelijk een hypervirulent Xcc isolaat ontstaat op Arabidopsis.
Dit isolaat kunnen we dan testen op deze Arabidopsis populatie in een GWAS toets waarbij kwantitatieve
vatbaarheid willen scoren m.b.v. een digitale plant phenotyper. Deze vatbaarheid is dan grotendeels
onafhankelijk van ‘herkenning door het immuunsysteem’. Deze digitale plant phenotyper (imager) is in de
zomer van 2020 succesvol in gebruik genomen.

Milestone 4 & 5 zijn nog niet gestart.

Naam projectleider

Harrold van den Burg
Terug